Università degli Studi “Tor Vergata” di Roma
Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica
per Immagini: Sezione di Genetica

LA TECNICA SFHR NELLA TERAPIA GENICA DELLA SMA

Titolo del progetto:

CORREZIONE GENICA E DIFFERENZIAZIONE DI CELLULE EMBRIONALI STAMINALI MURINE IN MOTONEURONI: UN MODELLO SPERIMENTALE PER L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA)

SOMMARIO

L’Atrofia Muscolare Spinale è una patologia neuromuscolare, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata dalla degenerazione degli a-motoneuroni. Circa 94% dei soggetti affetti da SMA risultano deleti in omozigosi per il gene SMN1. La copia centromerica SMN2, produce principalmente una proteina non funzionale a causa di un fenomeno di splicing alternativo dovuto ad una transizione C?T nell’esone7. Per questo motivo l’esone7 di SMN2 è considerato un target terapeutico per una possibile cura della SMA. Ad oggi non esiste un trattamento terapeutico risolutivo per questa malattia.

Il programma di ricerca prevede l’applicazione di una tecnica non virale di terapia genica chiamata SFHR (Small Fragment Homologous Replacement) finalizzata alla conversione del gene umano SMN2 in SMN1 (copia funzionale), al fine di ripristinare livelli funzionali di proteina SMN full-length. A tale scopo saranno trasfettati frammenti di DNA “terapeutico” di 498bp (sintetizzati in vitro) omologhi all’esone7 del gene SMN1 Per gli esperimenti saranno utilizzate cellule staminali embrionali ottenute dal modello murino SMA (Smn -/-,SMN2+/+). Successivamente le cellule corrette saranno differenziate in vitro in motoneuroni per verificare la loro funzionalità. Le cellule staminali embrionali murine derivano dal topo knockout SMA gentilmente ottenuto dal Prof. Arthur Burghes (Ohio, USA). Questo modello transgenico risulta deleto del gene Smn murino, mentre presenta nel loro genoma due copie del gene SMN2 umano. Il fenotipo di questo topo riproduce strettamente il difetto patologico che caratterizza i pazienti SMA e pertanto rappresenta un ottimo modello di studio per esperimenti di terapia genica in vivo ed ex vivo.

Di recente nel nostro laboratorio è stata applicata con successo la tecnica di gene targeting SFHR: ripristinando livelli funzionali di proteina SMN in cellule fetali umane prelevate da un paziente affetto da SMA.

LA MALATTIA

Le atrofie muscolari spinali (SMA) sono un gruppo eterogeneo di patologie neuromuscolari, caratterizzate da degenerazione dei motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinale. Le forme a trasmissione autosomica recessiva sono state classificate in tre tipi, sulla base dell’età dell’insorgenza, la capacità motoria e l’aspettativa di vita. La SMA di tipo I è la forma più grave ed è caratterizzata da grave debolezza muscolare ed ipotonia. La SMA di tipo II è la forma intermedia; i pazienti non sono in grado di stare in piedi né di camminare senza aiuto. La SMA di tipo III è la forma più lieve, cronica. La SMA è una delle più diffuse malattie genetiche dell’infanzia, a trasmissione autosomica recessiva, con un’incidenza di 1 su 6000 e una frequenza di portatori sani pari a 1 su 40. La regione cromosomica 5q13, dove mappa il locus malattia, presenta infatti una elevata complessità ed instabilità genomica dovute alla presenza di ampie regioni duplicate che coinvolgono diversi geni e pseudogeni. E' stato ormai definitivamente chiarito che la patogenesi della malattia è riconducibile alla perdita in omozigosi nei pazienti della copia telomerica del gene SMN (Sopravvivenza del MotoNeurone), deleto in maniera specifica nei cromosomi dei pazienti SMA. In circa il 94% dei pazienti affetti da SMA è assente in omozigosi il gene SMN1 (survival motor neuron gene), e questa delezione causa una degenerazione specifica a carico degli -motoneuroni del midollo spinale. La proteina SMN è parte di un complesso in cui sono coinvolte più molecole, chiamato SMN, che svolge un ruolo fondamentale nell’assemblaggio delle ribonucleoproteine (snRNPs). Inoltre i pazienti SMA presentano almeno una copia del gene duplicato SMN2, che agisce come modulatore positivo del fenotipo clinico. SMN2 è praticamente identico a SMN1 ma differisce per il pattern di splicing infatti produce circa il 90% di un trascritto privo dell’esone 7 che per questo motivo codifica per una proteina instabile dal punto di vista biochimico. La copia centromerica del gene, detta SMN2, presenta un'unica differenza critica rispetto ad SMN1 che ne altera lo splicing. La maggior parte dei trascritti di SMN1 contiene i 9 esoni del gene, mentre la maggior parte dei trascritti prodotta da SMN2 manca dell’esone 7. Esiste una relazione inversa tra il numero delle copie di SMN2 e la gravità dell’atrofia muscolare spinale, è stato infatti dimostrato che nei pazienti SMA di tipo II e III è presente un maggior numero di copie del gene SMN2 rispetto ai pazienti SMA di tipo I. Diverse strategie sono state messe in atto per incrementare la produzione della proteina SMN nelle cellule di pazienti SMA, inclusa la terapia genica e l’uso di farmaci o oligonucleotidi antisenso capaci di prevenire lo “skipping” dell’esone 7 nel trascritto SMN2 agendo a livello del processo di splicing.

La modulazione del fenotipo è probabilmente dovuta alla minima quantità di trascritto "completo" che il gene SMN2 riesce comunque a produrre. Questa evidenza è stata confermata anche da studi su modelli murini di SMA, nei quali è stata osservata un' attenuazione del fenotipo clinico in relazione all'induzione dell'espressione di extra copie del gene SMN2. Su questa evidenza sperimentale si basa il nostro programma di ricerca che prevede l’applicazione di due diversi approcci di terapia genica.

Se i protocolli di terapia molecolare proposti avranno successo nel ripristinare livelli fisiologici di espressione del gene SMN si potrà pensare di applicare l’uso del nostro protocollo come terapia a lungo termine per i feti/bambini affetti da questa malattia. Inoltre i risultati potranno costituire un modello per lo sviluppo di ricerche di terapia con cellule staminali anche per altre patologie del midollo spinale come la sclerosi laterale amiotrofica e le lesioni acquisite.

LA TECNICA SFHR

Nell’ambito dei diversi protocolli sperimentali di terapia genica, la tecnica SFHR (Small Fragment Homologous Replacement) risulta potenzialmente di grande interesse per vari motivi: non prevede l’impiego di sequenze virali, né di gene di supporto esogeni e/o di promotori o di induttori di ricombinazione di diversa natura biologica, in quanto utilizza frammenti di DNA di circa 500-700 nucleotidi sintetizzati in vitro, che una volta introdotti nella cellula sono in grado di effettuare la sostituzione omologa “mirata” unicamente al gene di interesse.

Questo processo ricombinativo avviene probabilmente durante la fase di replicazione del DNA attraverso un meccanismo tuttora sconosciuto. Questa metodica e’ stata inizialmente utilizzata dal nostro gruppo e da altri con successo in vitro e in vivo per la correzione di mutazioni responsabili di patologie monogeniche quali la Fibrosi Cistica, la distrofia muscolare di Duchenne, l’anemia falciforme e la SCID.

Attraverso questo protocollo è possibile modificare stabilmente la sequenza nucleotidica del DNA, mantenendo nello stesso tempo inalterata l’organizzazione genomica necessaria per la sua fisiologica espressione e regolazione. La recente applicazione di questa tecnica alle cellule staminali ha dimostrato la possibilità di utilizzare questo tipo di cellule per sviluppare approcci di terapia genica ex vivo finalizzati al trattamento di patologie umane come la SMA, per cui fino ad oggi trattamenti convenzionali non hanno dato alcun esito positivo. Inoltre è stato ormai dimostrato che le cellule embrionali possono differenziare in vitro e in vivo in motoneuroni funzionali

IL PROGETTO

Le cellule staminali murine (Smn-/-,SMN2+/+) saranno trasfettate con frammenti di DNA terapeutico omologhi all’esone 7 del gene SMN1. Nelle cellule trasfettate sarà valutata (mediante analisi su DNA – mRNA – proteina) la conversione del gene SMN2 in SMN1 e successivamente le cellule corrette saranno differenziate in motoneuroni.

OBIETTIVI

1. Isolamento e caratterizzazione delle cellule ES da modello murino affetto da SMA
(Smn-/-/SMN2+/+)

2. Ottimizzazione di protocolli di colture cellulari e applicazione della tecnica SFHR al fine di ripristinare livelli funzionali di espressione della proteina SMN. Isolamento di popolazioni cellulari clonali modificate. La conversione del gene SMN2 in SMN1 sarà determinata mediante analisi molecolari e biochimiche con lo scopo di valutare:

• presenza del sito di restrizione BsmI e della sequenza nucleotidica omologa al gene umano SMN1;
• aumento della quantità di trascritto SMN1;
• aumento della quantità di proteina funzionale SMN ;
• aumento del numero di gems localizzate all’interno del nucleo.

3. Differenziamento in vitro delle cellule ES modificate in motoneuroni funzionali. Questo sarà valutato mediante l’analisi di marcatori specifici di espressione (analisi molecolare ed immunoistochimica). Inoltre il processo di differenziamento ci permetterà di valutare la diversa funzionalità dei motoneuroni derivati dalle cellule staminali embrionali corrette rispetto a quelli derivati da cellule staminali il cui genotipo risulta ancora privo della sequenza selvatica del gene.

PROSPETTIVE FUTURE

Dopo aver valutato la conversione genomica del gene SMN ed il ripristino di livelli funzionali di proteina SMN full-length, le cellule corrette potrebbero essere trapiantate in nei topi SMA neonati con lo scopo di ripristinare il fenotipo selvatico.

Per questa ricerca l'Associazione ha investito finora € 50000,00

GENETISTA NOVELLI, METODO POTREBBE APRIRE CURA IN UTERO
(ANSA) - ROMA, 20 lug - Un gruppo di ricercatori dell'universita' di Roma Tor Vergata, grazie ad un nuovo metodo di terapia GENICA che non utilizza virus ma solo paticelle 'terapeutiche' di Dna, e' riuscito per la prima volta a correggere in provetta il difetto di cellule umane portatrici di atrofia muscolare spinale (Sma). Lo studio che appare sul numero di luglio della rivista Human Gene Therapy per la sua innovativita' potrebbe aprire la strada ad una terapia GENICA della malattia in utero cioe' nel grembo materno.

Lo studio, coordinato da genetista Giuseppe Novelli (primo ricercatore Federica Sangiuolo) e' stato condotto grazie al finanziamento di due associazioni dei malati e ha utilizzato alcune cellule fetali chiamate trofoblasto affette da Sma prelevate alla dodicesima settimana di gravidanza.''Le cellule - ha spiegato Novelli - sono state trattate con un frammento di Dna terapeutico iniettato nel nucleo di ciascuna cellula malata che e' riuscito a correggere il difetto genetico. Il risultato dell'esperimento - ha aggiunto - e' che c'e' stato un aumento produzione della proteina determinante per lo sviluppo della malattia, e questo incremento si e' mantenuto stabile nel tempo''.

La malattia (affligge un neonato su 10.000), ha spiegato il genetista, provoca la degenerazione dei motoneuroni e si sviluppa durante la vita embrionale, per cui alla nascita i bambini non muovono gli arti; per ora non esiste una cura. ''La particolarita' del metodo di terapia GENICA - ha sottolineato Novelli - e' che non si usano virus come navette per correggere il patrimonio genetico delle cellule malate ma solo particolari frammenti di Dna che una volta inoculati direttamente nel nucleo tramite microiniezioni sono in grado di far produrre le molecole giuste e non piu' quelle difettose che determinano la malattia. Il metodo della microiniezione nucleare del Dna terapeutico e' stato messo a punto dall'americano Dieter Gruenert dell'universita' di San Francisco ed e' la prima volta che con questa tecnica si e' ottenuta una prova funzionale: il gene riparato ha ripreso a funzionare e produrre la proteina mancante. Inoltre le cellule umane sulle quali e' stato condotto l'esperimento ( i trofoblasti) hanno mostrato caratteristiche di staminalita' e questo apre nuove speranze; si tratta di cellule che si possono ottenere dai feti fin dalla decima settimana di gravidanza. ''Si apre cosi' - conclude Novelli - la possibilita' di fare terapia GENICA in utero, utilizzando cellule fetali prelevate direttamente dal feto malato, correggendole e reinserendole, senza problemi di rigetto''.
(ANSA)

Modificazione SFHR-mediata del locus SMA in vitro in cellule di trofoblasto umane

L'Atrofia Muscolare Spinale è una patologia neuromuscolare, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata dalla degenerazione degli a-motoneuroni. Circa il 94% dei soggetti affetti da SMA risultano deleti in omozigosi per il gene SMN1. La copia centromerica SMN2, produce principalmente una proteina non funzionale a causa di un fenomeno di splicing alternativo dovuto ad una transizione C?T nell'esone7. Per questo motivo l'esone7 di SMN2 è considerato un target terapeutico per una possibile cura della SMA. Ad oggi non esiste un trattamento terapeutico risolutivo per questa malattia. In questo studio e' stata applicata la tecnica di ”gene targeting“ Small Fragment Homologous Replacement, per indurre a livello genomico nel gene SMN2 la transizione T?C, al fine di ripristinare livelli di espressione fisiologici della proteina SMN funzionale. A tale scopo sono stati trasfettati in vitro, mediante elettroporazione e microiniezione, frammenti di DNA (498pb) omologhi all'esone7 del gene SMN1, in 5 diverse colture di villi corionici umani. Le cellule SMA trasfettate, analizzate mediante Rel-Time PCR, hanno mostratato un incremento di mRNA full-lenght fino al 53% rispetto ai controlli non trasfettati. Esperimenti di immunoistochimica e western-blot hanno inoltre evidenziato un incremento di due volte della proteina SMN1. La stabilità della correzione a livello genomico e fenotipico è stata confermata ulteriormente dopo circa 2 mesi di coltura. Questi risultati dimostrano per la prima volta la possibilità di ripristinare livelli funzionali della proteina SMN, in cellule fetali umane attraverso la modificazione sito-specifica del DNA genomico, suggerendo un potenziale uso di questa tecnica per la correzione del fenotipo SMA.
Lavoro finanziato dal Ministero della Sanità e da ASAMSI, Fondazione Famiglie SMA, Fondazione Federica e Associazione Girotondo.