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Progetto SMA Torino

TRAPIANTI DI CELLULE STAMINALI IN UN MODELLO DI ATROFIA MUSCOLARE SPINALE

Dott.ssa Patrizia Muzzi

L’atrofia muscolare spinale è una malattia genetica causata dalla mancanza del gene SMN (survival motor neuron protein – proteina per la sopravvivenza del motoneurone). L’assenza della proteina codificata da questo gene causa una progressiva degenerazione delle cellule nervose del midollo spinale che controllano il movimento (i motoneuroni) con conseguente atrofia dei muscoli scheletrici. Esistono forme della malattia con diversi gradi di gravità. Se il gene manca solo nel motoneurone, ma è presente nel muscolo, la proteina prodotta dal muscolo protegge il motoneurone che lo innerva, e questo è sufficiente per prevenire la malattia.

Il progetto intende trapiantare cellule staminali mesenchimali per via sistemica (endovena) o intramuscolare in un modello sperimentale della malattia nel topo, in modo che le cellule trapiantate possano fornire la proteina alle fibre nervose dei motoneuroni. Noi ci aspettiamo quindi che le cellule MSC possano fondersi con le fibre muscolari, salvare i motoneuroni e prevenire l’atrofia muscolare.
In questi mesi abbiamo caratterizzato il ceppo di topi che abbiamo deciso di utilizzare come modello sperimentale, il quale presenta un fenotipo simile a quello della SMA di tipo III. Questo modello, in cui la malattia è presente in forma più lieve, ci permette di trapiantare cellule mesenchimali e di osservarne gli effetti a lungo termine. La scelta delle cellule di tipo mesenchimale è dovuta alla semplicità della tecnica di prelievo, al fatto che siano pluripotenti, cioè possono differenziarsi in diversi tipi di tessuto (es: cartilagine, tessuto osseo, tessuto muscolare) e poiché non presentano i problemi etici delle staminali embrionali qualora si intendano poi utilizzare quelle umane, Le cellule mesenchimali sono prelevate da tessuti di topi verdi fluorescenti in modo da poterle visualizzare comodamente nell’animale ricevente.
I topi affetti da SMA di tipo III, che possiedono una sola copia del gene SMN2, sono più piccoli, meno attivi e presentano debolezza muscolare. La loro aspettativa di vita è inferiore all’anno e alla fine di questa presentano movimenti ridotti, fanno fatica a respirare, perdono peso e riducono le interazioni sociali. Uno dei muscoli più colpiti è il gastrocnemio presente negli arti inferiori. Si calcola una riduzione fino al 30% del numero di motoneuroni a livello lombare e a livello del nucleo del faciale. La perdita dei motoneuroni è un evento tardivo nella SMA. Le elettromiografie effettuate da altri gruppi di ricerca indicano che la denervazione (perdita di fibre nervose che innervano il muscolo) si verifica tra il 4° e il 6° mese. Insieme alla denervazione si osserva lo “sprouting” degli assoni, cioè l’emissione di nuovi prolungamenti nervosi. In questi mesi abbiamo caratterizzato tramite PCR (polymerase chain reaction) il genotipo delle nidiate ottenute dai primi incroci. Abbiamo controllato il peso delle varie nidiate in modo da poterlo confrontare con quello di topi sani. Abbiamo inoltre eseguito il test Rotarod a cadenza settimanale per verificare l’abilità motoria dei malati rispetto a quella dei sani e ottenere dei parametri da confrontare con quelli degli animali malati che subiranno trapianto di cellule mesenchimali. Abbiamo messo a punto la tecnica di trapianto delle cellule che eseguiamo microiniettando due microlitri di soluzione contenete le cellule mesenchimali (50.000 cell/microlitro) a livello dei muscolo gastrocnemio. Abbiamo osservato la presenza di cellule sopravvissute dopo il trapianto che stiamo analizzando tramite tecniche di immunoistochimica per capire se si siano integrate nel tessuto muscolare ed eventualmente in quale tipo di cellule si siano differenziate. Inoltre abbiamo messo a punto la tecnica per osservare le placche neuromuscolari, cioè il contatto tra la fibra nervosa e quella muscolare. Le placche neuromuscolari si modificano in seguito all’evolversi della malattia. Tramite un apposito marcatore (la alfa-bungarotossina) e l’uso del microscopio a fluorescenza, noi osserviamo le alterazioni di della placca neuromuscolare nei topi malati rispetto ai sani. Inoltre stiamo studiando il midollo spinale a livello lombare per lo studio dei motoneuroni (i neuroni che controllano il movimento facendo contrarre i muscoli), per valutare il decorso della malattia in relazione alla morte dei motoneuroni. L’età raggiunta dagli animali da noi trapiantiati non ci ha ancora permesso di osservare miglioramenti dovuti al trapianto in quanto a peso e a test comportamentali (la malattia diventa sintomatica nel topo attorno a un anno di vita). Solo recentemente si in un test comportamentale detto “clasping” abbiamo evidenziato come in effetti vi sia un certo livello di rigidità degli arti posteriori nei topi malati. In parallelo agli studi comportamentali, stiamo analizzando il materiale raccolto in questi mesi dopo avere effettuato trapianti intramuscolo e dopo avere prelevato e congelato i tessuti. In contemporanea, abbiamo preso contatti con altri gruppi di ricerca per stabilire delle collaborazioni per inserire dei geni con funzione neuroprotettiva nelle cellule staminali mesenchimali, in modo che, quando trapiantate, queste cellule producano molecole con funzione neuroprotettiva per impedire la morte dei motoneuroni.