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Progetto Traumi Midollari

Aggiornamento 2011, abstract

Il trapianto acuto di precursori neurali nella compressione del midollo spinale riduce la cisti gliale e migliora la funzionalità

Un danno traumatico al midollo spinale determina spesso deficit neurologici irreversibili e permanenti al di sotto del sito di lesione, ed è considerato uno stato patologico di danno funzionale ai neuroni locali e alle fibre assonali. Ci sono diversi trattamenti sperimentali per ridurre il danno tissutale e recentemente il trapianto di cellule è emerso come un promettente approccio nella riparazione del midollo spinale. Gli autori hanno intrapreso questo studio per valutare il trapianto di precursori del tubo neurale come una possibile strategia terapeutica in un modello di compressione del midollo spinale nel topo.
Il danno traumatico da compressione è stato prodotto a livello T-13 in topi maschi adulti. Immediatamente dopo la lesione, i precursori neurali (NP) sono stati trapiantati nella lesione in 18 topi, altri 19 topi hanno ricevuto la somministrazione di soluzione salina nella lesione e sono stati utilizzati come controlli. I midolli spinali sono stati esaminati 12, 19 e 26 giorni dopo la lesione per analizzare la sopravvivenza dei NP e i loro effetti sull’ambiente cellulare, sulla cicatrice gliale e sulla formazione della cisti gliale, sull’astrogliosi e sull’attivazione della microglia.
I precursori neurali trapiantati sono sopravvissuti e si sono integrati nel tessuto spinale ospite. Alcuni NP sono differenziati in cellule che esprimono marker gliali e neuroni a tutte e tre le date di sacrificio. L’analisi del volume della cisti gliale ha mostrato una riduzione del volume della lesione pari al 63,2% nei topi trattati con NP rispetto ai topi lesionati ma non trattati. Non vi era alcuna differenza nella attivazione della microglia e dell’astroglia tra topi trattati e non. Test sensitivi e motori hanno dimostrato che il trapianto di NP ha promosso un miglioramento negli animali lesionati e trattati rispetto agli animali di controllo.
Questi risultati supportano il potenziale terapeutico dei NP, dimostrando che sono in grado di sopravvivere per lungo tempo, differenziare, integrarsi nel midollo spinale danneggiato e promuovere il recupero funzionale dopo un trauma spinale.

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Aggiornamento, 2011
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Pubblicazione originale, 2009
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UTILIZZAZIONE DI CELLULE STAMINALI NELLA CURA DEI TRAUMI MIDOLLARI

Dott.ssa Boido

Un danno traumatico al midollo spinale consiste nella perdita di fasci di fibre nervose che conducono informazioni motorie e sensitive, determinando paralisi agli arti e al tronco e perdita di sensibilità. Senza dubbio, si tratta di una delle cause più frequenti e drammatiche di invalidità permanente nei soggetti colpiti, producendo profondi effetti psico-sociali, devastanti per i pazienti e i familiari, nonché un’elevata spesa sanitaria per l’assistenza e le cure necessarie.
In seguito alla lesione meccanica, si verificano una serie di eventi patologici secondari (danni vascolari, stress ossidativo, variazioni dei neurotrasmettitori e degli elettroliti, infiammazione e morte di neuroni, astrociti e oligodendrociti). Il risultato finale è una complessa situazione di malfunzionamento, in cui gli assoni danneggiati non riescono a ricrescere e quelli rimasti intatti diventano inutilizzabili a causa della perdita del rivestimento mielinico. Inoltre alcune cellule della glia (astrociti) si attivano in risposta al trauma e formano una cicatrice che, pur volendo essere un tentativo di circoscrivere l’area di lesione, costituisce a tutti gli effetti una barriera per gli assoni recisi che tentassero di ricrescere o ricollegarsi alle cellule un tempo innervate.
Per la cura di tale patologia, oltre all’approccio farmacologico e chirurgico, è possibile utilizzare una terapia cellulare che consistente nel trapianto di cellule staminali: si tratta di cellule immature, non specializzate, capaci di proliferare e auto-rinnovarsi, potenzialmente in grado di produrre cellule figlie differenziate e funzionali, rigenerare un tessuto dopo una lesione subita e secernere particolari sostanze neurotrofiche per promuovere la riparazione del danno. Esse rappresentano pertanto uno degli strumenti a nostra disposizione più promettenti nella cura di patologie neurodegenerative.

Lo scopo della mia ricerca è stato riprodurre su topo una lesione midollare e trapiantare cellule staminali (neurali o mesenchimali) nella zona danneggiata: sono stati poi valutati la sopravvivenza di tali cellule, la loro proliferazione e gli eventuali effetti della loro azione (diminuzione dell’infiammazione, riduzione della cicatrice gliale, ricrescita delle fibre nervose).
Nello specifico si è scelto di realizzare una lesione da compressione su topi adulti, esponendo il midollo spinale e poggiandovi sopra un peso da 10g per 5 minuti. Subito dopo la rimozione del peso, sono stati iniettati 2 microlitri di soluzione fisiologica negli animali di controllo e altrettanti microlitri di sospensione cellulare negli animali trapiantati.
Le cellule staminali scelte per essere iniettate sono di due tipi e sono entrambe ottenute da topi transgenici fluorescenti verdi, in modo da poter facilmente distinguere le cellule trapiantate da quelle dell’ospite. Si tratta di cellule mesenchimali (MSC), ottenute da femore e tibia di animali di 8 settimane di età, che sono state messe in coltura e successivamente staccate, contate e risospese al momento del trapianto. Le altre cellule utilizzate sono precursori neuronali e gliali (NRP/GRP) ottenuti dal tubo neurale (la struttura embrionale che darà origine al midollo spinale) e anch’esse sono state contate e risospese con soluzione fisiologica per essere subito iniettate. Gli animali lesionati e lesionati/trapiantati sono stati poi sacrificati dopo 12, 19 o 26 giorni e sono stati prelevati i rispettivi midolli spinali. Inoltre prima dell’intervento e 4 – 7 – 12 – 19 – 26 giorni dopo, sia gli animali trattati che i controlli sono stati sottoposti al training per i test comportamentali, per monitorare le funzioni motorie e sensitive in condizioni fisiologiche e successivamente patologiche.

Finora sono stati riscontrati gruppi di cellule sopravvissute, a tutte e tre le date di sacrificio: le cellule risultano distribuite prevalentemente nella regione posteriore del midollo spinale (laddove viene poggiato il peso e vengono iniettate le cellule), benché in alcune sezioni siano state osservate cellule anche all’altezza della porzione anteriore. Inoltre talvolta sono presenti cellule morte, fagocitate da macrofagi. La sopravvivenza risulta comunque generalmente buona anche fino a 26 giorni dalla lesione/trapianto, soprattutto per quanto riguarda i precursori neuronali/gliali. Inoltre questi ultimi sembrano disporsi preferibilmente attorno all’area lesionata, mentre le mesenchimali paiono riuscire a penetrarla. Sottoponendo i campioni a nostra disposizioni ad un serie di reazioni immunoistochimiche, abbiamo rilevato che in alcuni casi le cellule trapiantate (in prevalenza quelle prelevate dal tubo neurale) possono esprimere markers gliali e neurali (segno forse di un’eventuale promozione di differenziamento in senso neurale) a tutte e tre le date di sacrificio. Ed in seguito alle reazioni effettuate abbiamo potuto realizzare una quantificazione dell’astrogliosi reattiva e della microglia attivata (segni di neuroinfiammazione): non abbiamo registrato però significative differenze tra gruppi di controllo e trapiantati. Tuttavia stiamo ultimando una serie di esperimenti riguardo lo studio del volume della lesione: dati preliminari evidenziano come gli animali trattati (in particolare quelli trapiantati con precursori neuronali/gliali) mostrino spesso una cicatrice gliale di dimensioni ridotte rispetto ai semplici controlli. Inoltre nei test comportamentali sono stati registrati degli apprezzabili miglioramenti negli animali trattati rispetto ai controlli: la percentuale di funzionalità recuperata risulta infatti simile nei due gruppi presi in esame, anche se sembrerebbe che gli animali trapiantati recuperino un po’ più velocemente rispetto agli sham. Questi risultati ci fanno quindi ben sperare sulla potenzialità terapeutica delle cellule utilizzate: esse sono infatti in grado di sopravvivere per lungo tempo, integrarsi nel tessuto ospite, talvolta differenziarsi e promuovere un recupero funzionale dopo una lesione.

Nell’arco dell’anno abbiamo partecipato ad alcuni congressi, nei quali sono stati presentati i dati raccolti e che ho qui riassunto:
– Boido M., Muraca G., Garbossa D., Ducati A., Fontanella M., Vercelli A., “Transplantation of different stem cells after spinal cord injury in adult mice”, Prima Riunione Dottorandi e Borsisti italiani in Neuroscienze e Materie Affini, Torino, 30/03/07-01/04/07
– Boido M., Garbossa D., Muraca G., Ducati A., Fontanella M., Vercelli A., “Survival and effects of stem cells transplantation in an experimental model of spinal cord injury”, Congresso Nazionale della Società Italiana di Neuroscienze, Verona, 27-30/09/2007
– Inoltre parteciperemo al 6° Forum organizzato dalla FENS (la Federazione delle Società Europee di Neuroscienze) che si terrà a Ginevra in data 12-16/07/08.